2ª PRÁCTICA

07/10/19
PRÁCTICA Nº2: "DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE HEMOGLOBINA"
Analito: Hemoglobina
Método: Drabkin. Colorimétrico.

PRINCIPIO DEL MÉTODO
La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina.
La intensidad del color formado es proporicional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra ensayada.

SIGNIFICADO CLÍNICO
La hemoglobina es una proteína que contiene hierro, otorga el color rojo a la sangre. Se encuentra en los glóbulos rojos y es la encargada del transporte de oxígeno por la sangre desde los pulmones a los tejidos. Cuando el nivel de hemoglobina aparece por debajo de los niveles normales indica anemia que puede obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias.
Si el nivel de hemoglobina es alto puede deberse a cardiopatías, deshidratación o estancia en lugares de gran altitud.
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

REACTIVOS

• HEMOGLOBIN 50x (Reactivo de Drabkin): Ferricianuro de potasio, Cianuro de potasio, Dihidrógeno fosfato de potasio.
• HEMOGLOBIN CAL: Patrón de Hemoglobina de Origen animal.
  

PREPARACIÓN
Reactivo de trabajo (RT):
- Para 5 mL: 4'9 mL agua destilada + 2 gotas de Reactivo.
Mezclar bien.
Estabilidad: 2 meses en nevera a 2-8ºC, protegido de la luz.

CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
Todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial, cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita la contaminación durante su uso.
No usar reactivos fuera de la fecha indicada.
Indicadores de deterioro de los reactivos:
- Presencia de partículas y turbidez.
- Absorbancia (A) del Blanco a 540 nm mayor o igual a 0'012.

MATERIAL NECESARIO

• Puntas de micropipeta amarillas.
• Pipeta automática de 10 microlitros.
• Bote de orina ("contenedor de desechos").
• Agua destilada.
• Gradilla para cubetas de espectrofotómetro con 2 cubetas de fotometría.
• Gradilla.
• 4 tubos eppendorf.
• Pipeta graduada de 5 ml y auxiliar de pipeteado azul.
  

MUESTRA

• Sangre venosa en un tubo con anticoagulante (EDTA).
  
  
  

PROCEDIMIENTO

1. En primer lugar, encender el espectrofotómetro y ajustarlo a 540 nm frente a agua destilada.
   
2. Seguidamente, la 1ª mesa ha procedido a preparar el RT para todos los grupos de la clase.
3. Una vez preparado el reactivo de trabajo (RT), depositar en el tubo de ensayo rotulado previamente como "Blanco", 2'5 mL del RT.
4. Después, depositar en el tubo rotulado como "Patrón", 2'5 ml del RT + 10 microlitros del calibrador.
5. Por último, echar en el tubo de ensayo rotulado previamente como "Muestra", 2'5 ml de RT + 10 microlitros de la sangre venosa contenida en el tubo con EDTA.
   
   
6. Mezclar por inversión (una vez tapado el tubo de ensayo con un tapón) e incubar 3 minutos a temperatura ambiente (15-25ºC).
   
7. Una vez transcurrido el tiempo, leer la absorbancia del calibrador y la muestra, frente al Blanco de reactivo.
   
   
   
   
   
   
   

CÁLCULOS
- Con Patrón:

[(A) Muestra : (A) Patrón] x 15 = g/dL de hemoglobina en la muestra.

RESULTADOS
(0'357 A: 1'035 A) x 15 = 5'17 g/dL de hemoglobina en la muestra.
Absorbancia del Blanco: 0'000 A (540 nm).

VALORES DE REFERENCIA
- Hombres 14-18 g/dL
- Mujeres 12-16 g/dL

CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

1. Rango de medida: Desde el límite de detección de 0'108 g/dL hasta el limite de linealidad de 20 g/dL.
2. Sensibilidad analítica: 1 g/dL = 0'027 A.
3. Exactitud: Los reactivos de SPINREACT no muestran diferencias sistemáticas significativas cuando se comparan con otros reactivos comerciales.

INTERFERENCIAS
Se han descrito varias drogas y otras sustancias que interfieren en la determinación de la hemoglobina.

OBSERVACIONES

• El reactivo de Drabkin se oxida, por ello, debemos guardarlo envuelto en papel de aluminio.
• Blanco + disolvente: elimina interferencias.
• El calibrador está comprendido en un intervalo de números mientras que el patrón en un número exacto.
• En esta práctica sólo hemos realizado el método MICRO.
• El patrón, además, puede extrapolar datos y el calibrador permite hacer una curva de calibración.
• Encender el espectrofotómetro 15 minutos antes de comenzar la práctica, ya que puede tardar cierto tiempo en cargarse.